原發(fā)登革熱IgG間接法檢測試劑

Panbio Dengue IgG Indirect ELISA 

產(chǎn)品目錄號01PE30

預(yù)期用途

Panbio Dengue IgG Indirect ELISA用于定性檢測登革熱病原血清型（1、2、3和4）血清中的IgG抗體，輔助臨床實(shí)驗(yàn)室診斷出現(xiàn)臨床癥狀或既往感染登革熱病毒的患者。

概述

蟲媒病毒中的登革熱屬通過蚊子傳播，主要是埃及伊蚊和白紋伊蚊。 登革熱病毒感染，與傷寒病有關(guān)，其特征是突然發(fā)熱、劇烈頭痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛和皮疹。 登革熱感染的嚴(yán)重并發(fā)癥包括登革出血熱和登革休克綜合征。此類并發(fā)癥的發(fā)病率增加與繼發(fā)性感染不同登革熱血清型有關(guān)。

通過ELISA對四種登革熱血清型的IgG類特異性抗體進(jìn)行檢測，是一種診斷既往感染登革熱病毒的患者的重要方法。 配對血清中IgG， 水平不斷升高是活動性登革熱感染的表現(xiàn)。傳統(tǒng)上，血凝抑制試驗(yàn)（HAI）滴度被用于劃分原發(fā)性或繼發(fā)性感染。當(dāng)前的界定方法是采用及時分離至少7天的配對血清標(biāo)本檢測，急性標(biāo)本的HAI滴度≥ 1:2560被認(rèn)為患者感染了繼發(fā)性黃病毒¹。

檢測原理

血清中存在的登革熱病毒抗體，與微孔測試條上聚苯乙烯表面附著的登革熱抗原結(jié)合物相結(jié)合。 洗去剩余的血清并添加過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體。清洗微孔，再添加無色的底物系統(tǒng) - 四甲基聯(lián)苯胺/過氧化氫（TMB顯色液）。底物被酶水解后，顯色液變藍(lán)。用酸終止反應(yīng)后，TMB變黃。顯色表示測試樣本中存在登革熱IgG抗體。

提供的材料

• 登革熱抗原（血清型1、2、3和4）包被微孔板-（12x8孔）。即用型。未使用的微孔應(yīng)該立即重新密封并儲存于干燥環(huán)境中。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
• 清洗緩沖液（20倍） - 1瓶，60mL 20倍濃縮磷酸鹽緩沖鹽水（pH 7.2 – 7.6），含吐溫 20和防腐劑（0.1% Proclin™）。低溫可能結(jié)晶。若去除結(jié)晶，可在37℃孵育液體至澄清。混合均勻。用19體積的蒸餾水稀釋1體積的清洗緩沖液。稀釋后的緩沖液可在2-25℃儲存一周。
• 樣本稀釋劑 – 2瓶， 50 mL（粉色）。即用型。Tris緩沖生理鹽水（pH 7.2 – 7.6），含防腐劑（0.1% Proclin™）和添加劑。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
• HRP標(biāo)記抗人IgG – 1瓶，15mL（綠色）。即用型。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗人IgG，含防腐劑（0.1% Proclin™）和蛋白穩(wěn)定劑。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
• TMB顯色液（TMB） - 1瓶，15mL。即用型。3,3’,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫的混合物，存放于枸櫞酸鹽緩沖液中（pH 3.5 – 3.8）。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
• 陽性質(zhì)控品 – 1瓶，紅色瓶蓋，200μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
•  校準(zhǔn)品 – 1瓶，黃色瓶蓋，850μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
• 陰性質(zhì)控品 – 1瓶，綠色瓶蓋，200μL人血清（含0.1%疊氮話鈉和0.005%硫酸慶大霉素）。有效期內(nèi)儲存于2-8℃可保持穩(wěn)定。
• 終止液 – 1瓶，紅色瓶蓋，15mL。即用型。1M磷酸。有效期內(nèi)儲存于2-25℃可保持穩(wěn)定。

Proclin™ 300是Rohm 和Haas公司的注冊商標(biāo)。

需要但未提供的材料

• 精確、可調(diào)節(jié)的微量移液器，含一次性吸液頭（5-1000 μL容積）
• 去離子水
• 標(biāo)板清洗系統(tǒng)
• 酶標(biāo)儀，含450nm濾波器
• 計時器
• 刻度量筒
• 燒瓶
• 試管或微滴定板，用于稀釋血清

注意事項

用于體外診斷

• 在制備質(zhì)控品的過程中使用的所有人源性材料已經(jīng)過人類免疫缺陷病毒1/2（HIV 1 /2）抗體、丙肝（HCV）和乙肝表面抗原的檢測，結(jié)果為陰性。但是，任何測試方法都不能*確信，且所有人源性質(zhì)控品和抗原包被微孔板都應(yīng)按照潛在傳染性材料處理。疾病控制和預(yù)防中心以及美國國立衛(wèi)生研究院建議將潛在傳染原按照生物安全二級²處理。
• 該測試只能使用血清執(zhí)行。尚未建立使用全血、血漿或其它標(biāo)本基質(zhì)的方法。
• 不可使用黃疸或脂血癥血清，以及出現(xiàn)溶血或微生物生長的血清。
• 不可加熱，否則血清將失去活性。
• 在開始檢測前所有試劑必須平衡至室溫（20-25℃）。檢測受溫度變化的影響。微孔板在達(dá)到室溫（20-25℃）之前不可從密封袋中取出。
• 直接用干凈的吸液頭從試劑瓶中吸出試劑。轉(zhuǎn)移試劑可能導(dǎo)致污染。
• 未使用的微孔應(yīng)該立即重新密封并儲存于干燥環(huán)境中。否則將產(chǎn)生錯誤結(jié)果。
• 底物系統(tǒng)：
  • 由于TMB易受金屬離子的污染，所以底物系統(tǒng)不能與金屬表面接觸。
  • 避免長時間陽光直射。
  • 有些清潔劑可干擾TMB的性能。
• TMB可能呈現(xiàn)淡藍(lán)色，這不影響底物的活性或測定結(jié)果。累積。
• 疊氮話鈉還抑制酶標(biāo)物的活性。在添加酶標(biāo)物時必須使用干凈的吸液頭，避免攜帶其它試劑的疊氮話鈉。

標(biāo)本采集和制備

靜脈穿刺獲取的血液應(yīng)該置于室溫（20-25℃）下直到凝塊形成，再按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究院（CLSI）的《認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)——診斷用血液標(biāo)本的靜脈穿刺采集程序，H3》離心。應(yīng)該盡快分離血清。如果在2天內(nèi)不進(jìn)行檢測，血清應(yīng)該2-8℃冷藏或者低于或等于- 20℃冷凍儲存。不*使用自解凍冷凍機(jī)儲存血清。不*使用黃疸血清，以及出現(xiàn)溶血、脂血或微生物生長的血清。CLSI提供了儲存血液標(biāo)本的建議，《認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)——血液標(biāo)本的處理加工程序，H18》。

檢測程序

注： 確保所有試劑在開始測定前平衡至室溫（20-25℃）。在所給時間和溫度范圍以外進(jìn)行測試可能產(chǎn)生無效的結(jié)果。不在預(yù)定時間和溫度范圍內(nèi)的測試必須進(jìn)行重復(fù)。

ELISA程序

• 從鋁箔袋中取出所需數(shù)量的微孔板并插入測試條槽。陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和校準(zhǔn)品各需5個微孔，一式三份。確保剩下未使用的微孔密封于鋁箔袋內(nèi)。
• 使用適當(dāng)?shù)脑嚬芑蛭⒌味ò逑♂岅栃再|(zhì)控品（P）、陰性質(zhì)控品（N）、校準(zhǔn)品（CAL）和患者樣本。
  • 混合10μL血清與1000μL樣本稀釋劑。混合均勻。 

或者，

• 混合10μL血清與90μL樣本稀釋劑。取出20μL稀釋血清，加入180μL樣本稀釋劑。混合均勻。

• 吸取100 µL樣本稀釋劑、質(zhì)控品和校準(zhǔn)品添加至對應(yīng)的微孔中。
• 蓋住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
• 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）。
• 吸取100 µL HRP標(biāo)記抗人IgG添加到每個微孔中。
• 蓋住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
• 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）。
• 吸取100 µL TMB添加到每個孔中。
• 在室溫（20-25℃）下孵育10分鐘，從第①次添加開始計時。藍(lán)色將會顯現(xiàn)。
• 按照相同順序吸取100μL終止液添加到每個孔中，計時同TMB添加步驟。混合均勻。藍(lán)色將變成黃色。
• 在30分鐘內(nèi)讀取每個孔在450nm波長的吸光度，參考濾波器為600-650nm。

注： 如果使用雙波長分光光度計，將參考濾波器設(shè)定在600-650nm之間。在沒有參考濾波器的情況下讀取450nm的微孔結(jié)果可能由于背景原因?qū)е挛舛绕摺?/span>

清洗程序

為了清除未復(fù)合的樣本或成分，有效清洗是ELISA程序的關(guān)鍵步驟。

A.自動洗板機(jī)

• *抽凈所有微孔。
• 在清洗循環(huán)期間將每個孔裝滿至邊緣（350μL）。
• 完成6次清洗后，將測定板倒立于吸水紙巾上用力敲打，確保清除所有清洗緩沖液。
• 為了確保有效清洗，必須維持自動洗板機(jī)良好的保養(yǎng)。必須始終遵守廠商的清潔說明。

B.手動清洗

• 將測定板的內(nèi)含物丟棄到適當(dāng)?shù)膹U物容器。
• 用適當(dāng)?shù)臄D壓瓶將微孔填滿清洗緩沖液。避免清洗緩沖液起泡，否則會降低清洗效率。立即丟棄微孔里的清洗緩沖液。
• 再將微孔填滿清洗緩沖液，并立即丟棄。
• 重復(fù)步驟（3）4次，共用清洗緩沖液清洗六（6）次。
• 后一次清洗完成后，丟棄微孔的內(nèi)含物并將測定板置于吸水紙巾上敲打，以確保清除所有清洗緩沖液。

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